細(xì)胞培養(yǎng)基 Dulbecco 改良的Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco modified Eaglemedium，DMEM）、血清、碳酸氫鈉和青鏈霉素購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；dNTP 和 Taq 酶購(gòu)自日本 TaKaRa 公司；Hank 液購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司。PTC-200PCR 儀為美國(guó)Bio-Rad 公司產(chǎn)品；miniMAG 自動(dòng)核酸提取儀為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品；NU-4750E 細(xì)胞培養(yǎng)箱、NU-425-400E IIA2型生物安全柜為美國(guó) Nuaire 公司產(chǎn)品；ECLIPSE80i 熒光顯微鏡為日本 Nikon 公司產(chǎn)品；二級(jí)安德森微生物氣溶膠采樣器由遼陽(yáng)市應(yīng)用技術(shù)研究所提供；DV40 型全玻璃直角氣溶膠發(fā)生器由北京比賽福生物安全技術(shù)有限公司提供。 氣溶膠主動(dòng)發(fā)生的模擬 在生物安全柜正常運(yùn)轉(zhuǎn)情況下，在柜內(nèi)將 10 ml rAdvGFP 病毒液置于 DV40 全玻璃直角氣溶膠發(fā)生器內(nèi)。發(fā)生器和安德森采樣器的擺放位置如圖 1A，發(fā)生器管口距離安全柜臺(tái)面約 12 cm。分別在距離發(fā)生器管口 0、10 和 20 cm 處的安全柜臺(tái)面上放置采樣器和培養(yǎng)皿，用于病毒氣溶膠和沉降病毒顆粒的采集。采樣器分上下兩層，其采樣撞擊孔孔徑分別為 0.5 和0.2 μm，內(nèi)置培養(yǎng)皿，在每組采樣器的內(nèi)側(cè)平行位置放置 3 個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放置 5 ml 采集液，在氣溶膠發(fā)生 30 s 后，計(jì)時(shí)連續(xù)采集 5 min，收集各采樣器及培養(yǎng)皿中的液體進(jìn)行檢測(cè)。1.2.2 吹打及振蕩模擬試驗(yàn) 將 10 ml 病毒液置于 50 ml 離心管中，離心管距離安全柜操作臺(tái)面約12 cm。在模擬吹打的操作中，用微量移液器反復(fù)吸取吹打病毒液，期間避免病毒液溢灑和噴濺；在模擬振蕩操作中，將 10 ml 病毒液置于 50 ml 離心管中，用振蕩器的最大速度渦旋振蕩病毒液1 min 后立即打開(kāi)管蓋采集 2 min，然后蓋緊再次震蕩 30 s 后開(kāi)蓋繼續(xù)采集，模擬振蕩的操作見(jiàn)圖 2A。兩組模擬操作中，均在距離離心管管口0 和 10 cm處的安全柜臺(tái)面上放置采樣器，在采樣器的內(nèi)側(cè)平行位置放置培養(yǎng)皿進(jìn)行病毒的采集，均采集 5 min 后收集各采樣器及培養(yǎng)皿中的采集液進(jìn)行檢測(cè)。1.2.3 病毒濃縮 將采樣器和培養(yǎng)皿中的采集液收集到 15 ml 離心管中，加入終濃度為 400 μg/μl的陽(yáng)離子多聚物聚凝胺（polybrene，PB），置 37 ℃孵育 30 min，于室溫 2300 × g 離心 40 min 后棄上清，懸于 800 μl 不含血清的 DMEM 孵育液，得到濃縮后樣本。取濃縮后的樣本 200 μl 接種至24 孔板上培養(yǎng)單層的人胚腎 293 細(xì)胞（8 × 104 細(xì)胞/孔），每個(gè)樣本接種 2 孔，700 × g 室溫低速離心 45 min，在 37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育 1 h后棄去孵育液，更換含 2% 胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后，在熒光顯微鏡下觀察GFP 熒光。對(duì)未見(jiàn)明顯 GFP 熒光出現(xiàn)的樣本連續(xù)培養(yǎng) 3 代，培養(yǎng) 3 代后仍未見(jiàn) GFP 熒光的則認(rèn)為病毒未復(fù)制。所有試驗(yàn)均重復(fù) 3 次。1 . 2 . 4 PCR 檢測(cè) 取 200 μ l 濃縮樣本用miniMAG 自動(dòng)核酸提取儀提取病毒核酸，用腺病毒特異性引物進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。腺病毒檢測(cè)引物序列分別是上游 AdVF：5’ GCCSCARTGGKCWTACATGCACATC 3’；下游 AdVR：5’ CAGCACSCCICGRATGTCAAA 3’[7]。PCR 反應(yīng)體系，10 × 緩沖液2 μl、10 mmol/L 的 dNTP 0.4 μl、50 μmol/L 上、下游引物各 0.3 μl、5 U/μl 的 Taq DNA 聚合酶0.2 μl、滅菌雙蒸水 14.8 μl、核酸 2 μl，總體積為20 μl。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取 5 μl 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2% 瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增目的片段大小為301 bp。為了評(píng)價(jià)安德森采樣器的采樣效率以建立方便的病毒氣溶膠采集體系，首先用氣溶膠發(fā)生器模擬病毒氣溶膠的主動(dòng)發(fā)生，將采樣器和采集沉降病毒的平行放置培養(yǎng)皿中的采集液經(jīng) PB 濃縮后，進(jìn)行核酸檢測(cè)和接種 293 細(xì)胞，觀察病毒的復(fù)制。在距離發(fā)生器管口 0 和 10 cm 處放置的各培養(yǎng)皿和采樣器以及在距發(fā)生器管口 20 cm 處放置的培養(yǎng)皿和采樣器 2 中均檢測(cè)到病毒核酸，但置于20 cm 處的采樣器 1 未檢測(cè)到病毒核酸。用上述樣本接種 293 細(xì)胞，在培養(yǎng) 48 h 后均可在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞中的綠色熒光。這些結(jié)果表明，在距離發(fā)生器管口 0、10 和 20 cm 處放置的不同孔徑的采樣器中均可采集到病毒氣溶膠（圖 1B、1C）。